Зал в палаці Holy Rood. Він розповідає, що в місті заворушення. Якийсь незнайомий йому чоловік на чолі натовпу - ряджених, в масках, танцюристів з бубонцями, людей в чорних капюшонах - погрожував, передбачав і закликав народ не підкорятися королеві. Придворний королеви Річчіо підтверджує, що він теж час від часу спостерігає, як народ жадібно слухає ці проповіді. Паж розповідає далі, що народ увірвався в каплицю королеви з криками: «Гніздо папістів!», Що блазень Дарнлея - чоловіка королеви - схопився на вівтар і почав зображати проповідь, а народ відповідав йому знущальними куплетами. Королева Марія Стюарт в розпачі. Вона відчуває ненависть народу, більшість придворних залишили її; вона дивується, як може її християнство так відрізнятися від християнства народу Шотландії. Річчіо пропонує негайно підготувати указ про покарання винних у заворушеннях. Марія диктує його пажу, паж уточнює, вписувати чи ім'я Генріха Дарнлея - чоловіка королеви. Марія коливається; вона підозрює, що безлади інспіровані саме їм - адже натовпом був перед блазень короля. Тут Річчіо нагадує їй, що це вона королева; вона як сонце, і право карати вона має від Бога. Він вимагає негайно викликати чергового офіцера для оприлюднення указу королеви. Входить Дуглас. Марія велить йому віднести папір королівському канцлеру Мортону, щоб той поставив печатку. Дуглас переглядає указ і бачить, що в ньому немає імені короля. Він запитує про це королеву. За неї відповідає Річчіо. Дуглас втрачає самовладання. Він закликає королеву не застосовувати кривавих заходів придушення, натякає, що бачить в цьому французьке або італійське вплив. Але королева холодно нагадує йому про свою владу усувати непокірних її волі підданих. Вибухає сварка між Річчіо і Дугласом, Дуглас викликає Річчіо на поєдинок і клянеться, що завтра вб'є венеціанця. Королева віддаляється і веде Річчіо. Дуглас залишається один, він обмірковує поєдинок. Входить Мортон. Дуглас показує йому указ. Мортон в нерішучості: він боїться гніву і короля, і королеви. Чи не прикладаючи друку, Мортон несе указ королю. В цей час Генріх зайнятий розмовою зі своїм блазнем Ніком, який поддразнивает його тим, що реальну владу в Шотландії має королева, а Генріх - тільки її чоловік, що королева вибирає собі наближених, наприклад, цього італійського арфіста Річчіо ... В цей час Мортон приносить нещасливий указ. Король в гніві, він вирішує вбити Річчіо. Входить придворний короля Ліндсей, він кличе короля пополювати з тільки що придбаним соколом. Мортон відповідає, що сьогодні у короля вже є заняття. Ліндсей охоче примикає до змови проти Річчіо. Він буквально забороняє вбивати Річчіо сьогодні ввечері, тому що повинен сам убити його завтра вранці. Тоді Генріх, скориставшись відстрочкою, посилає блазня до астролога, щоб дізнатися, яке розташування зірок для його намірів.
Астролог у своїй лабораторії (він одночасно і алхімік) міркує сам з собою про те, що досвід підтверджує марність науки, що призначення, воля зірок панують над людиною, розпоряджаються добром і злом. Входить блазень Нік, сипле дотепами, астролог не поступається йому в дотепності. Нік повідомляє, що король послав його спитати про долю Річчіо і підказує астролога, щоб він передбачив Річчіо смерть. Астролог відповідає, що підказувати йому будуть зірки, а не люди, і в свою чергу передбачає смерть блазневі. З тим він і йде. З'являється викликаний астрологом паж королеви. Паж обожнює свою пані. Астролог велить йому передати королеві, що сьогодні помре людина, яку вона любить. «Як, Ботвел сьогодні помре?» - вигукує паж. Астролог спантеличений. Він мав на увазі Річчіо і квапить пажа, щоб він попередив про це. Залишившись один, астролог замислюється - по зірках теж виходило, що Ботвел якось похмуро пов'язаний з королевою - через Марс, Сатурн ... Входить Ботвел. З його монологу стає ясно, що він несподівано для себе самого опинився в будинку астролога. Зрозумівши, куди він потрапив, Ботвел запитує у астролога, скільки йому залишилося жити. Старий відповідає, що три роки і що Ботвел буде королем. Ботвел виймає флакон з отрутою, за допомогою якого він хотів накласти на себе руки, хоче його викинути - і роздумує. Адже в атмосфері палацових інтриг всяка зброя стане в нагоді. Він йде.
Паж повідомляє королеві, що скоро прийде Річчіо. Королева чекає його з нетерпінням - на її думку, він один залишився їй вірний. «А Ботвел?» - запитує паж. «Хто це - Ботвел?» - цікавиться королева. Здивований паж розповідає Марії, як під час катання на човнах сильний вітер зірвав з голови королеви троянду, квітка впав у воду. І тоді один з придворних - Ботвел - кинувся в човен і страшно поганяв весляра, щоб виловити троянду з води. Вислухавши розповідь, Марія відсилає пажа, щоб помолитися. Богу вона визнається, що немає у неї більше сил чинити опір своїй любові до Ботвелу. Королева знає, що при дворі її вважають закоханий в Річчіо. Входить Річчіо. Марія повідомляє про небезпеку, яка йому смертельної небезпеки і холодно прощається з ним, вказуючи йому корабель, який відвезе його в Рим. У розпачі Річчіо намагається вблагати королеву скасувати рішення про його від'їзд. Королева непохитна.
Генріх, Мортон і Ліндсей дізналися про підготовлюваний від'їзді Річчіо і поспішно радяться, убити його або дати йому відплисти. Тут з'являється Дуглас і повідомляє, що Річчіо уже відійшов. Дуглас в розпачі, він жадає кривавої помсти, його лицарська честь зачеплена. Раптово вони зустрічають пажа, який несе королеві записку від Річчіо - він не поїхав і буде у неї ввечері. Змовники віднімають записку.
Марія у себе в кімнаті зайнята вишиванням. Прийшовши Річчіо пояснює їй, що не міг виїхати, оскільки у нього поєдинок з Дугласом вранці. Він зізнається, що життя без її любові йому не потрібна. Він просить Марію віддати йому вінок з троянд - він поставить квіти на вівтарі в Римі ... Входять Генріх, Дуглас і Діндсей і вбивають Річчіо. Королева непритомніє. Дуглас вражений соромом і жахом - він добровільно видаляється у вигнання. Генріх стурбований, не зненавидить його королева. Ліндсей захоплює короля геть, нашіптуючи йому про майбутнього полювання. Входить запрошений королевою Ботвел. Марія приходить до тями, бачить Ботвела і зізнається йому в любові. Ботвел змушує її визнати, що вона хоче смерті Генріха і віддає їй свій флакон з отрутою, сказавши, що це снодійне. Марія передає королю це «ліки», але отрута випиває блазень. Однак уже ніщо не може зупинити вбивчу інтригу - Ботвел підриває будиночок короля Генріха. На віддалі чути наростаючі крики натовпу. Ботвел з королевою ховаються.